Human TNF-α ELISA Kit

康朗生物的Human TNF-α ELISA Kit (Human Tumor Necrosis Factor-α Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測人血清、血漿、細胞或組織裂解液、或細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α的試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強，重復性好。多次重復檢測結(jié)果表明，最小檢出量為4.3pg/ml，與人TNF-β、sTNF、小鼠TNF-α、RI sTNF、RII sTNF和大鼠TNF-α等均沒有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
TNF-α，即TNF、TNFα或TNFalpha，也稱cachectin、cachexin或TNFSF1A。TNF-α由巨噬細胞、上皮細胞等多種細胞在細菌感染、內(nèi)毒素刺激、病毒或寄生蟲感染時產(chǎn)生。腫瘤壞死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily)共約19個成員，包含由巨噬細胞等產(chǎn)生的TNF-α和T淋巴細胞產(chǎn)生的TNF-β(也稱Lymphotoxin-alpha)，以及FASL、TRAIL、CD40L、CD27L、CD30L等。TNF-α與TNF-β在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，并且在氨基酸水平有28%的同源性，它們擁有共同的受體TNFR1和TNFR2。由于TNF-α的生物學活性占TNF總活性的70%~95%，因此目前常說的TNF多指TNF-α。TNF (Tumor Necrosis Factor)因為能誘導細胞死亡而得名，實際上其很多時候誘導的細胞死亡為細胞凋亡。人TNF-α有兩種形式，一種是由233個氨基酸組成的跨膜蛋白同源三聚體(homotrimers)，另外一種是該跨膜蛋白在TNF-α轉(zhuǎn)化酶TACE(TNF-α converting enzyme)的作用下切除信號肽，形成成熟的157個氨基酸的可溶性TNF-α單體(分子量為17KDa)的同源三聚體。無論TNF-α的跨膜同源三聚體還是可溶性同源三聚體(51kD)，都具有生物學活性，但活性的差異目前仍有爭議。小鼠和人的TNF-α有約79%的氨基酸同源性，也同樣形成同源三聚體發(fā)揮作用。TNF-α可以誘導產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、發(fā)燒(fever)、細胞凋亡、抑制腫瘤形成和病毒復制等。TNF-α也參與了包括哮喘、克羅恩氏病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、阿茲海默癥、肥胖癥、II型糖尿病、自身免疫病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展。

圖1. TNF-α的信號通路示意圖

TNF-α被誘導分泌后，其同源三聚體與受體TNFR1(TNF receptor, type I)或TNFR2(TNF receptor, type II)結(jié)合而引發(fā)其下游信號通路的一系列反應(yīng)。TNF-α的信號通路參見圖1。TNFR1在大多數(shù)組織中有表達，而TNFR2主要在免疫細胞中表達。TNF-α的跨膜同源三聚體和可溶性同源三聚體都可以完全激活TNFR1，而TNFR2僅對TNF-α的跨膜同源三聚體產(chǎn)生響應(yīng)。
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見圖2。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當加入標準品或樣品時，其中的靶蛋白會與捕獲抗體結(jié)合。當加入生物素化的抗靶蛋白抗體后，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復合物。隨后加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。靶蛋白濃度與A450值呈正比，通過繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中靶蛋白濃度。

圖2. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標準品檢測，可以進行96次檢測。
保存條件：
除標準品外，4℃保存6個月內(nèi)有效。標準品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效。注意TMB溶液避光保存。
注意事項：
由于標準品一般是凍干粉，在制備后需要嚴格校準，所以標準品的瓶數(shù)及每瓶標準品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標準品標簽上的標注為準。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。。
如果發(fā)現(xiàn)TMB辣根過氧化物酶顯色液出現(xiàn)混濁或顏色變成藍色，應(yīng)該停止使用。
加樣時，請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導致結(jié)果誤差較大。
檢測標準品和樣品時建議設(shè)置重復孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. 樣品準備
a. 樣品的準備請按下列流程進行操作：
(a) 細胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b) 對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c) 對于血漿樣品，采集的全血使用肝素或者EDTA進行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d) 若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復凍融。
b. 血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c. 樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d. 請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準確。
注：血清或血漿樣品可能需要用樣品分析緩沖液適當稀釋后再檢測。
2. 檢測前準備工作
a. 試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
b. 配制適當量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c. 按標準品標簽上標注的體積加入標準品稀釋液至1瓶標準品中，室溫孵育15分鐘(為確保標準曲線的準確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標準品徹底溶解，使標準品終濃度達到1000pg/ml。通常每個濃度的標準品需要檢測2個孔，每個孔的標準品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標準品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標準品，并在合并混勻后使用。
d. 取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標準品稀釋液，并參考圖3進行標準品的倍比稀釋，最終得到1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml共六個標準品濃度，最后將稀釋好的標準品依次加入預(yù)包被板孔中，標準品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標準品濃度。

圖3. 標準品倍比稀釋示意圖。按標準品(STANDARD)標簽上標注體積加入標準品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標準品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。

3. 洗滌方法
自動洗板機或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當用力拍干。
4. 實驗過程需自備的材料和儀器
a. 不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b. 酶標儀
c. 自動洗板機(如果沒有也可以手工洗板)
d. 去離子水或雙蒸水
5. 操作步驟
a. 計算并確定一次實驗所需的預(yù)包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b. 每次實驗都需配制標準品并繪制出標準曲線，同時建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c. 分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿樣品，可以加入50μl樣品分析緩沖液后加50μl樣品；如稀釋比例大，將樣品與樣品分析緩沖液等量加入，不足部分用標準品稀釋液補充至100μl。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請適當稀釋或濃縮后再進行檢測。
d. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e. 加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g. 加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin 100μl/孔。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當延長孵育時間。
h. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i. 加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時需要適當延長孵育時間，此時可以孵育至標準品和樣品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化。
j. 加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6. 結(jié)果分析
a. 復孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復孔平均值可作為測量值。
b. 每個標準品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c. 繪制標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖4. Human TNF-α ELISA Kit的標準曲線。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

d. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！