背景^[1-3]

人溶酶體相關(guān)膜蛋白2(HLAMP-2)ELISA試劑盒是采用ELISA（酶聯(lián)免疫）方法，用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中溶酶體相關(guān)膜蛋白2(HLAMP-2)的含量。

標(biāo)本要求

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能人上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

人溶酶體相關(guān)膜蛋白2(HLAMP-2)ELISA試劑盒

操作步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

應(yīng)用^[4][5]

用于系統(tǒng)性血管炎患者臨床特點(diǎn)及生物標(biāo)記物的相關(guān)研究

研究SV患者中紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、高遷率組蛋白B1（HMGB1）、溶酶體相關(guān)膜蛋白2（LAMP-2）及其自身抗體的表達(dá)水平,分析RDW、HMGB1、LAMP-2及其自身抗體其與SV臨床指標(biāo)的相關(guān)性,并評判其臨床診斷及病情評估價值。

方法：選擇明確診斷為SV的患者86例,同期收集與之年齡和性別相匹配的原發(fā)性高血壓（EH）患者46例和健康對照（HC）者86例,收集所有研究對象的一般臨床資料和血清標(biāo)本,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的方法測定血清HMGB1水平,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血清中IL-8和IL-23的水平。觀察SV及其亞組間血清HMGB1水平變化及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。

采用ELISA的方法檢測各組間血清LAMP-2及其自身抗體水平,觀察各組間血清LAMP-2及其自身抗體水平的表達(dá)差異。分析血清LAMP-2及其自身抗體水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系。進(jìn)一步評估LAMP-2及其自身抗體聯(lián)合診斷對于高血壓人群中SV患者鑒別診斷的價值。結(jié)果:部分:SV患者可見于任何年齡段,其中以30-40歲和51-60歲年齡段最為常見,男女比例約為1:1。SV亞組中,AAV患者年齡主要分布在50歲以上人群,男女比例約為1:1;PAN患者年齡主要集中在31-60歲之間,男女比例約為1:1,男性略多于女性;TA患者年齡主要分布在40歲以下人群,男女比例約為1:2.2。

此外,SV患者以腎臟受累、高血壓和發(fā)熱為最常見首發(fā)臨床癥狀。SV亞組中,AAV患者最常見的首發(fā)臨床表現(xiàn)主要為腎臟受累、肺臟受累和高血壓;PAN、TA患者最常見的首發(fā)臨床表現(xiàn)主要為高血壓、發(fā)熱和頭痛。SV患者病程中最常見的臨床表現(xiàn)為腎臟受累,其次為高血壓。SV亞組中,AAV患者病程中的臨床表現(xiàn)以腎臟受累、肺臟受累、高血壓最為常見;PAN患者病程中的臨床表現(xiàn)以腎臟受累、高血壓、頭痛最為常見;TA患者病程中的臨床表現(xiàn)以高血壓、頭痛、發(fā)熱最為常見。

進(jìn)一步把合并高血壓的SV患者根據(jù)血壓水平分為Ⅰ-Ⅲ級,結(jié)果顯示AAV合并高血壓患者血壓水平以Ⅰ-Ⅱ級為主;PAN和TA合并高血壓患者血壓水平以Ⅱ-Ⅲ級為主。在SV亞組中,白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞沉降率（ESR）、超敏C-反應(yīng)蛋白（Hs-CRP）和血清肌酐（Scr）在AAV患者中的水平顯著高于PAN和TA患者;而紅細(xì)胞（RBC）和血紅蛋白（HB）在AAV患者中的水平顯著低于PAN和TA患者。

SV活動期患者RDW水平顯著高于非活動期患者和HC。此外,SV腎損傷患者RDW水平顯著高于非腎損傷患者和HC。相關(guān)分析表明,RDW與伯明翰血管炎活動期評分（BVAS）、Hs-CRP、ESR、Scr和WBC呈顯著正相關(guān),與HB呈顯著負(fù)相關(guān)。RDW是SV活動期發(fā)生的獨(dú)立危險因素。

參考文獻(xiàn)

[1]Clinical Usefulness and Prognostic Value of Red Cell Distribution Width in Colorectal Cancer[J].Yanfang Song,Zhengyuan Huang,Yanli Kang,Zhen Lin,Pingxia Lu,Qing Lin,Zhaolian Cai,Yingping Cao,Xianjin Zhu,Vasiliki Galani.BioMed Research International.2018

[2]Takayasu Arteritis Presenting as Renovascular Hypertension[J].Taro Horino,Osamu Ichii,Tatsuki Matsumoto,Yoshio Terada.JCR:Journal of Clinical Rheumatology.2018

[3]Clinical features and structured clinical evaluation of vasculitis[J].C.Ponte,A.F.águeda,R.A.Luqmani.Best Practice＆Research Clinical Rheumatology.2018

[4]Introduction,epidemiology and classification of vasculitis[J].Richard A.Watts,Joanna Robson.Best Practice＆Research Clinical Rheumatology.2018

[5]朱彬.系統(tǒng)性血管炎患者臨床特點(diǎn)及生物標(biāo)記物的相關(guān)研究[D].新疆醫(yī)科大學(xué),2019.