背景^[1-3]

三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒是一種用于快速靈敏檢測三叉奧斯特線蟲的試劑盒，基于PCR原理開發(fā)而成。該試劑盒具有以下特點：

高特異性：與其他病毒無交叉反應(yīng)，無非特異性擴增。

高靈敏度：檢測靈敏度可達10~100拷貝。

三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒操作簡便：該系列所有試劑均采用相同的體系和條件，產(chǎn)品僅用于科研可同時進行多個檢測。

高通量：多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。

三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒使用時，用戶只需提供DNA模板，將試劑盒與模板、引物和水混合后進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取部分產(chǎn)物進行電泳檢查即可觀察到擴增結(jié)果。此外，還有探針法熒光定量PCR試劑盒可用于對PCR產(chǎn)物進行定量分析。

需要注意的是，使用PCR反應(yīng)液時需在冰中配置，以保持其穩(wěn)定性。同時，為了確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議在多次重復(fù)實驗后取平均值作為最終結(jié)果。

三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒

三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒的操作步驟如下：

1.樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無菌容器中。

2.DNA提取：將采集到的樣本進行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下。

3.PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒說明書的要求，配制PCR反應(yīng)體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。

4.PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中，進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件和時間根據(jù)試劑盒說明書的要求進行設(shè)置。

5.結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進行熒光信號檢測，根據(jù)熒光信號的出現(xiàn)情況判斷是否存在三叉奧斯特線蟲的感染。

應(yīng)用^[4][5]

三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒可以用于奧氏奧斯特線蟲檢測方法的建立與應(yīng)用及其巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子功能鑒定

針對奧氏奧斯特線蟲巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子同系物進行研究。通過比對分析得出，OoMIF與Teladorsagia circumcincta MIF(TciMIF)雖然沒有相同的核苷酸序列，但其氨基酸的同源性達到了l00%，說明OoMIF和TciMIF是完全相同的蛋白。本研究通過原核表達系統(tǒng)分別表達OoMIF和OoMIF的突變體，該突變體將第二位的脯氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?/p>

三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)重組的OoMIF和OoMIF的突變體均不具備氧化還原酶活性，但OoMIF展現(xiàn)出很好的互變異構(gòu)酶活性，其活性單位為105μmol/min/mg，ISO-1抑制試驗證明，人類的MIF的抑制劑不能夠完全抑制OoMIF的互變異構(gòu)酶活性。OoMIF具有一定的抑制單核細(xì)胞移動作用但不是非常的明顯，能夠與人類MIF競爭與受體CD74結(jié)合且能后被巨噬細(xì)胞攝入胞內(nèi)。L3和L4階段線蟲的OoMIF含量很高，且主要位于分泌蛋白和排泄物抗原中。本研究也證明OoMIF能夠促進牛PBMC和U937細(xì)胞分泌IL-8and TNFа細(xì)胞因子。證明OoMIF在線蟲感染牛的過程中，很可能在調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)起到一定的作用。

本研究為建立簡單、便捷、快速的PCR檢測方法對奧氏奧斯特線蟲進行鑒別診斷，以GenBank公布的Ostertagia ostertagi間隔區(qū)ITS-2(登錄號為AB245023.2)為靶基因，利用分子生物學(xué)軟件Primer Primier5.0設(shè)計一對特異性PCR引物，通過三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒對PCR反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、dNTP添加量、引物濃度、Taq酶添加量及退火溫度分別進行優(yōu)化，以確定PCR的最佳反應(yīng)條件，結(jié)果證明其適宜反應(yīng)濃度為：3mM Mg2+，0.25mM dNTP，0.5μM引物濃度,0.5μL Taq酶(5U/μL)，其擴增最適退火溫度為57°C。對PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果證明其與GenBank公布的ITS-2序列的同源性達100%，從而證實三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒PCR擴增產(chǎn)物確為目的擴增產(chǎn)物。本研究同時建立了簡單、便捷、快速的熒光定量PCR檢測方法對奧氏奧斯特線蟲進行鑒別診斷，以O(shè)stertagia ostertagi ITS-2為靶基因,建立檢測奧氏奧斯特線蟲的熒光定量PCR檢測方法。

通過分子生物學(xué)軟件設(shè)計一對特異性熒光定量PCR引物,通過優(yōu)化三叉奧斯特線蟲PCR試劑盒反應(yīng)條件，并對實時熒光定量PCR的特異性、敏感性、可靠性的檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為：Y=－3.425x+39.79，曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.998，實驗結(jié)果證明SYBR Green I熒光定量PCR能檢測蟲卵的最低濃度為1×103拷貝/μL,而普通PCR能檢測的最低模板濃度為1×105拷貝/μL。表明該方法檢測蟲卵ITS-2的靈敏度是普通PCR的100倍。

參考文獻

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