背景^[1-3]

DH5Α感受態(tài)細胞是一種可以用于常規(guī)質粒高效轉化的質粒克隆化學感受態(tài)細胞，是實驗室最為常用的大腸桿菌菌株之一。它廣泛用于基因克隆、藍白篩選、質粒穩(wěn)定擴增等分子生物學實驗。

DH5Α感受態(tài)細胞的遺傳特性使其對外源DNA的攝取和質粒的穩(wěn)定保持具有高效性。這種細胞經(jīng)過特殊處理，如電擊法或CaCl2法等，使得細胞膜的通透性發(fā)生暫時性的改變，從而允許外源DNA分子進入，即成為感受態(tài)細胞。

DH5α菌株具有一些特殊的遺傳特點，如缺失核酸內切酶（endA），這有助于提高質粒DNA的產(chǎn)量和質量；同時，它是重組酶缺陷型（recA），這減少了插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA的穩(wěn)定性。此外，lacZΔM15是表達β-半乳糖苷酶α片段的一段基因，當M15缺失時，雖然lacZ基因能表達ω片段，但不能表達α片段，這使得β-半乳糖苷酶沒有活性。因此，DH5Α感受態(tài)細胞可以用于藍白斑篩選。

使用pUC19質粒進行熱激活轉化時，DH5Α感受態(tài)細胞的轉化效率可以高達1×10^8 cfu/μg DNA以上。其高轉化效率和穩(wěn)定性使其在分子生物學實驗中起到了關鍵作用，為基因工程和基因克隆提供了有效的工具。

DH5Α感受態(tài)細胞

DH5Α感受態(tài)細胞具體步驟如下：

a.將DH5α菌株接種到含有適當抗生素的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜。

b.取一定量的菌液，離心收集細菌沉淀。

c.用冰預冷的CaCl2溶液重懸細菌沉淀，使其濃度約為10^9 CFU/mL。

d.將重懸后的細菌懸液在冰上放置30分鐘。

e.將冰上的細菌懸液離心收集細菌沉淀，棄去上清液。

f.用冰預冷的DMSO溶液重懸細菌沉淀，使其濃度約為10^9 CFU/mL。

g.將重懸后的細菌懸液分裝到無菌的凍存管中，每管100μL。

h.將凍存管放入-80°C冰箱中保存，至少需要24小時才能使用。

應用^[4][5]

DH5Α感受態(tài)細胞可以用于超聲波介導質粒pUC19轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞轉化方法及機制的研究

利用超聲波介導質粒p UC19轉化大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)DH5Α感受態(tài)細胞。通過對超聲波介導外源DNA轉化宿主細胞模型的建立、E.coli DH5Α感受態(tài)細胞壁成分肽聚糖與金屬離子間的吸附關系、超聲波處理前后E.coli DH5Α感受態(tài)細胞膜通透性的變化、生物大分子物質含量的變化以及E.coli DH5Α感受態(tài)細胞外膜蛋白mrd B基因突變株的構建方面進行研究,以期揭示轉化發(fā)生的機制。研究結果表明,在二價金屬離子環(huán)境中,適宜條件的超聲波可介導外源DNA轉化進入宿主細胞。在本實驗中當E.coli DH5Α感受態(tài)細胞菌液OD600=0.40.6,超聲功率為40 W時,在35℃下處理E.coli DH5Α感受態(tài)細胞和質粒p UC19的混合液25 s,質粒p UC19轉化E.coli DH5α細胞的轉化效率最大可以達到1.006×107 CFU/μg DNA。

對超聲波處理前后E.coli DH5α細胞膜通透性的變化研究結果顯示,在最佳轉化條件下細胞膜通透性的變化是未經(jīng)超聲波處理的細胞膜通透性的10倍,然而不同超聲波條件下的轉化效率的變化與細胞膜通透性的變化不成正比,也與E.coli DH5Α感受態(tài)細胞存活率的變化不成正比,這是因為在最佳轉化條件菌液OD600值為0.40.6、超聲波功率為40 W、在溫度為35℃下處理25 s,超聲波作用對質粒DNA的完整性沒有損傷,對宿主細胞的破壞也很小,但超出此范圍后,質粒DNA的完整性受到破壞,同時宿主細胞由于其自身的調控與修復導致轉化率的不一致。

E.coli DH5Α感受態(tài)細胞壁成分肽聚糖與金屬離子、DNA互作結果顯示肽聚糖對金屬離子的吸附?jīng)]有專一性,無論是一價(Na+)金屬離子還是二價(Mg2+、Ca2+)金屬離子,肽聚糖均可與其發(fā)生吸附作用,但與DNA不能發(fā)生反應,證明在轉化發(fā)生時必不可少的二價金屬離子(Ca2+)有一部分與細胞壁成分肽聚糖發(fā)生了反應,為外源DNA進入宿主細胞提供了離子通道,但尚不能證明肽聚糖的存在決定轉化的發(fā)生。對超聲波處理前后宿主細胞E.coli DH5Α感受態(tài)細胞中的生物大分子物質檢測以及掃描電子顯微鏡與原子力顯微鏡觀察結果顯示,超聲波產(chǎn)生的氣穴與聲穴效應改變了宿主細胞的膜通透性、胞內結構等,導致胞內大分子物質透過細胞膜向胞外溢出,致使超聲波處理后的細胞出現(xiàn)褶皺、形態(tài)不均等現(xiàn)象。

參考文獻

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