背景^[1-3]

人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)Elisa試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)水平。用純化的人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入鈣網(wǎng)蛋白(CRT)，再與HRP標(biāo)記的鈣網(wǎng)蛋白(CRT)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的鈣網(wǎng)蛋白(CRT)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)濃度。

人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)Elisa試劑盒

人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)Elisa試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

7.不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)Elisa試劑盒操作程序：

1.預(yù)先計(jì)算好所需的板條數(shù)，實(shí)驗(yàn)前30 min，拿出試劑盒，恢復(fù)至室溫。

2.每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品工作液或檢測(cè)樣本（若樣本濃度高于檢測(cè)范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣），標(biāo)準(zhǔn)品需做復(fù)孔，封板后于37°C孵箱孵育90 min。

3.棄去液體，甩干，每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl生物素標(biāo)記瘦素抗體工作液至反應(yīng)孔中，封板后于37°C孵箱孵育60 min。

4.洗滌：棄去液體，甩干，每個(gè)反應(yīng)孔中加入350μl洗滌液，浸泡1-2 min，甩干洗滌液。重復(fù)4次。

5.每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl HRP標(biāo)記鏈霉親和素工作液至反應(yīng)孔中，封板后于37°C孵箱孵育30min。

6.洗滌：每個(gè)反應(yīng)孔中加入300μl洗滌液，間隔30 s，甩干洗滌液。重復(fù)4次。

7.每個(gè)反應(yīng)孔中加入90μl顯色劑（避光）至反應(yīng)孔中，封板后于37°C避光顯色15 min左右。

8.每個(gè)反應(yīng)孔中加入50μl終止液，即刻用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值（5 min內(nèi)）。

9.用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

10.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均OD值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。

11.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用“四參數(shù)logistics模型”繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

12.若樣本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。

應(yīng)用^[4][5]

人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)Elisa試劑盒可以用于聯(lián)合免疫原性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑和TLR9激動(dòng)劑的全細(xì)胞腫瘤疫苗的抗瘤活性研究

構(gòu)建一種聯(lián)合化療藥物誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡和TLR9激動(dòng)劑SD-101的全細(xì)胞腫瘤疫苗,檢測(cè)其對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的激活能力,分析其誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,并評(píng)估其抗腫瘤活性。

方法:本論文以小鼠肺腺癌細(xì)胞系LLC為腫瘤研究對(duì)象,米托蒽醌（MTX）為ICD誘導(dǎo)型化療藥物的代表。采用系列濃度MTX處理LLC,利用流式細(xì)胞術(shù)分析LLC的死亡情況、鈣網(wǎng)蛋白的暴露情況,驗(yàn)證MTX對(duì)LLC的ICD誘導(dǎo),并確定MTX的最佳應(yīng)用濃度。LLC經(jīng)MTX誘導(dǎo)死亡獲得垂死的LLC（MDL）,再通過(guò)體外共培養(yǎng)檢測(cè)MDL單獨(dú)或與SD-101聯(lián)合使用對(duì)DC抗原吞噬和活化功能的影響。我們進(jìn)一步利用足墊免疫模型分析MDL聯(lián)合SD-101（以下簡(jiǎn)稱MDLSD）在小鼠體內(nèi)激活T細(xì)胞應(yīng)答的能力。最后,建立小鼠肺腺癌模型,利用流式細(xì)胞術(shù)分析了MDLSD疫苗誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答;通過(guò)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng),繪制小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線、計(jì)算小鼠的無(wú)瘤率和生存周期,分析MDLSD疫苗的抗腫瘤的預(yù)防和治療效應(yīng);監(jiān)測(cè)小鼠體重變化,初步分析MDLSD疫苗的安全性。

人鈣網(wǎng)蛋白(CRT)Elisa試劑盒結(jié)果:本論文通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTX誘導(dǎo)LLC死亡并上調(diào)了細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá),證實(shí)此誘導(dǎo)為ICD誘導(dǎo)。再通過(guò)DC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到MDL促進(jìn)DC吞噬腫瘤細(xì)胞能力以及MDLSD促進(jìn)DC活化。在T細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中,MDLSD顯著促進(jìn)IFN-γ的分泌。預(yù)防性腫瘤模型顯示,MDLSD疫苗的保護(hù)率達(dá)100%,且這些無(wú)瘤小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,二次免疫攻擊實(shí)驗(yàn)顯示這些記憶T細(xì)胞應(yīng)答可提供長(zhǎng)期免疫保護(hù)。

參考文獻(xiàn)

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