背景^[1-3]

CD9抗體是一個(gè)非偶聯(lián)、分子量約25 kDa、兔源、抗CD9多克隆抗體。它可用于人、小鼠、大鼠背景下WB、IHC-P、ICC/IF、IP、FC實(shí)驗(yàn)，且不帶標(biāo)記。

CD9，即白細(xì)胞分化抗原9，別名MIC3、TSPAN29、GIG2、MRP1等。它是一種多次跨膜的糖蛋白，屬于四跨膜蛋白家族（Tetraspanin），在多種細(xì)胞表面表達(dá)，包括白細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等。CD9的作用機(jī)制涉及與多種蛋白質(zhì)相互作用，形成四跨膜蛋白富集的微區(qū)（TEMs），調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。CD9在細(xì)胞間的相互作用、免疫應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移、精卵融合等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。例如，在腫瘤細(xì)胞中，CD9的表達(dá)可能與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，而在免疫細(xì)胞中，它參與調(diào)節(jié)免疫突觸的形成和細(xì)胞外囊泡的功能。此外，CD9還可能作為某些疾病的治療靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物，具有重要的臨床應(yīng)用潛力。

CD9抗體

CD9抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（CD9抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CD9抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

CD9抗體可以用于MSCs源性外泌體對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后外周免疫反應(yīng)的作用研究

實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)分析MSCs源性外泌體對(duì)TBI后大鼠外周免疫細(xì)胞活化情況、炎癥因子表達(dá)水平、損傷腦組織炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況的影響,進(jìn)而評(píng)估MSCs源性外泌體對(duì)TBI后大鼠外周免疫反應(yīng)的干預(yù)效果,為探索TBI后外周免疫異常治療的新策略提供理論參考。

方法:1.取成年SD大鼠骨髓來(lái)源的充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),使用專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng),收取MSCs培養(yǎng)基上清液,利用超高速離心法從中分離出外泌體,并利用電鏡、納米顆粒跟蹤分析(NTA)以及CD9抗體蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)(WB)進(jìn)行外泌體鑒定。2.將成年SD大鼠(8周齡,180-220g)隨機(jī)分成4組,分別為假損傷組(Sham)、創(chuàng)傷性腦損傷組(TBI)、假損傷+外泌體組(Sham+exo)和創(chuàng)傷性腦損傷+外泌體組(TBI+exo)。隨后我們利用控制性皮層損傷方法來(lái)構(gòu)造SD大鼠腦創(chuàng)傷模型,在TBI組及TBI+exo組模型構(gòu)造后的6個(gè)小時(shí)內(nèi)將MSCs源性外泌體通過(guò)尾靜脈途徑注射入大鼠體內(nèi)。在術(shù)后第1、3、7、28天分別收集大鼠外周血,梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)以及血清,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞百分比,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的表達(dá)水平。對(duì)比各組間的差異,分析TBI對(duì)大鼠外周免疫反應(yīng)的誘發(fā)作用以及MSCs源性外泌體對(duì)TBI后外周免疫反應(yīng)干預(yù)作用。3.在TBI后第1、3、7、14、28天利用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)表評(píng)估各組大鼠運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能。在TBI后第1、3、7、28天分別處死各組部分大鼠,分離腦組織,利用尼氏染色和TUNEL染色觀察神經(jīng)元凋亡情況。將大腦皮層組織制備成勻漿,先利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦皮質(zhì)中促炎因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、TNF-α、IFN-γ和抑炎因子白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的表達(dá)水平。然后利用RT-PCR檢測(cè)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表面分子INOS和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表面分子Arg-1的表達(dá)水平。對(duì)比各組間差異,分析MSCs源性外泌體干預(yù)TBI大鼠外周免疫反應(yīng)后對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。

CD9抗體結(jié)果:1.通過(guò)控制性皮層損傷方法對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行打擊,并成功構(gòu)建TBI大鼠模型。通過(guò)皮層打擊后大鼠立即出現(xiàn)呼吸淺慢、毛發(fā)豎立等表現(xiàn),待大鼠清醒后則會(huì)出現(xiàn)打擊部位對(duì)側(cè)肢體癱瘓,向?qū)?cè)繞圈爬行,分離其腦組織發(fā)現(xiàn)右側(cè)大腦皮層出現(xiàn)明顯病灶。2.從MSCs中成功提取到外泌體。通過(guò)電鏡、納米顆粒跟蹤分析、CD9抗體Western Blot驗(yàn)證了其為直徑主要在100nm-200nm之間的呈典型的“杯盤(pán)”狀的囊性小泡,CD9、CD81表達(dá)明顯。

參考文獻(xiàn)

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