背景^[1-3]

CCT2抗體是一種可以特異性結(jié)合CCT2的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CCT2蛋白。CCT2作為含伴侶蛋白的T復(fù)合物(TRiC)的一個組成部分發(fā)揮作用，TRiC是一種復(fù)雜的分子伴侶復(fù)合物，對于通過ATP水解進行蛋白質(zhì)折疊至關(guān)重要。這種多功能復(fù)合物在介導(dǎo)包括WRAP53/TCAB1在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)的折疊中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，從而影響端粒的維持。此外，作為TRiC復(fù)合物的一部分，CCT2可能有助于BBSome的組裝，BBSome是纖毛發(fā)生所必需的復(fù)合物，可調(diào)節(jié)囊泡向纖毛的運輸。TRiC復(fù)合物參與肌動蛋白和微管蛋白的折疊，強調(diào)了其在細胞過程中的多方面功能（可能）。從結(jié)構(gòu)上看，CCT2是TRiC復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，TRiC復(fù)合物是一種異源寡聚體組裝體，其特征是兩個堆疊的環(huán)，每個環(huán)的直徑為12至16 nm。除了其結(jié)構(gòu)作用之外，CCT2還與多種蛋白質(zhì)相互作用，包括PACRG、FLCN和DLEC1，進一步凸顯了其在多種細胞過程中的重要性。

CCT2抗體

CCT2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（CCT2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CCT2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

CCT2抗體可以用于CCT2對肺腺癌細胞增殖、遷移的影響及其臨床意義

探討CCT2（chaperonin containning TCP1，subunit 2）在人肺腺癌中的表達、對肺腺癌細胞增殖、遷移生物學(xué)功能的影響及其與患者臨床特征的關(guān)系。

方法：通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析在肺腺癌組織及正常肺組織樣本中CCT2的表達差異，生存分析評價其表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系。CCT2抗體免疫組織化學(xué)法分別檢測CCT2、Ki-67在72例肺腺癌組織中的表達水平，并分析其表達水平與臨床病理特征之間的相關(guān)性。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、CCT2抗體Western blot檢測CCT2在肺腺癌細胞中的表達情況；A549、H1650、H1299細胞株分別轉(zhuǎn)染siRNA，分為si-NC組和si-CCT2組，qRT-PCR、Western blot驗證轉(zhuǎn)染效率，CCK-8實驗檢測肺腺癌細胞增殖能力，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。

結(jié)果：基于TCGA數(shù)據(jù)庫的肺腺癌數(shù)據(jù)分析表明，與正常肺組織相比，肺腺癌組織中CCT2的表達水平更高，CCT2的高表達與肺腺癌患者的總體生存率降低相關(guān)（P＜0.05）。qRT-PCR、Western blot檢測顯示，CCT2在肺腺癌細胞中高表達，CCT2抗體免疫組化顯示CCT2的表達與Ki-67表達呈正相關(guān)（P＜0.05）。CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示，A549、H1650細胞在轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，相比si-NC組，si-CCT2組細胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，A549、H1650細胞在轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，si-CCT2組細胞的遷移率低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：CCT2在肺腺癌細胞和組織中表達水平增加，敲低其表達可減弱A549、H1650肺腺癌細胞的增殖及遷移。

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