背景^[1-3]

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒采用的是雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)（ELISA）。測(cè)定樣品中人白介素17(IL-17)水平。向預(yù)先包被了抗人白介素17(IL-17)抗體的酶標(biāo)孔中，加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗白介素17A抗體。再與HRP標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入顯色底物TMB，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。最后，在450 nm處測(cè)定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD）值，樣本中的人白介素17(IL-17)濃度與OD值成正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中人白介素17(IL-17)的濃度。

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

7.不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒操作步驟：

1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

20ng/L 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

10ng/L 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

5ng/L 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.5ng/L 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1.25ng/L 1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2、加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4、配液：將30倍（48T的20倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30倍（48T的20倍）稀釋后備用

5、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6、加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7、溫育：操作同3。

8、洗滌：操作同5。

9、顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10、終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

應(yīng)用^[4][5]

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒可以用于白介素17（IL-17）在大腸埃希菌誘導(dǎo)的新生大鼠敗血癥中的意義

建立新生大鼠大腸埃希菌敗血癥模型,分析細(xì)胞因子IL-17在肺、肝組織中的表達(dá)以及血漿中水平的變化,來(lái)探討IL-17在新生大鼠敗血癥中的作用及機(jī)制,進(jìn)一步了解淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子工L-17和巨噬細(xì)胞表面CD163在炎癥反應(yīng)中的作用,通過(guò)其表達(dá)水平的變化了解機(jī)體的免疫狀況。

方法：選用7日齡無(wú)特定病原體(SPF級(jí))的Sprague-Dawley(SD)大鼠84只,雌雄不限,質(zhì)量16-20g,分為兩組,即對(duì)照組和敗血癥組,每組42只。所有動(dòng)物按照隨機(jī)原則分入實(shí)驗(yàn)后第2、4、6、8、12、24、48小時(shí)7個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為6只新生SD大鼠。敗血癥組采用腹腔注射大腸埃希菌(E.coli)方法來(lái)建立新生大鼠敗血癥模型；對(duì)照組則用采用腹腔注射等量生理鹽水的方法來(lái)建立新生大鼠對(duì)照組模型。對(duì)照組和敗血癥組分別于設(shè)定的七個(gè)時(shí)間點(diǎn)麻醉動(dòng)物,心臟采血,取肺臟和肝臟固定于福爾馬林中備用。用人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒檢測(cè)血漿中IL-17在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水平,用免疫組織化學(xué)分析的方法檢測(cè)肺組織、肝組織IL-17的表達(dá)。

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒結(jié)果：1.對(duì)照組新生大鼠血漿中IL-17和肺組織、肝組織IL-17各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；2.敗血癥組新生大鼠血漿中IL-17的表達(dá)水平,隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,至12小時(shí)左右達(dá)高峰,一直延續(xù)到48小時(shí)；3.敗血癥組新生大鼠肺組織中IL-17的表達(dá),隨著時(shí)實(shí)驗(yàn)間的延長(zhǎng),于12小時(shí)左右達(dá)到高峰,實(shí)驗(yàn)至48小時(shí)一直處于較高水平；4.敗血癥組新生大鼠肝組織IL-17的表達(dá),在實(shí)驗(yàn)至4小時(shí),肝組織中IL-17水平較高,隨后水平稍下降,但實(shí)驗(yàn)至12小時(shí)左右再次達(dá)到較高的水平,至實(shí)驗(yàn)48小時(shí)一直維持在較高水平；5.實(shí)驗(yàn)進(jìn)展至2小時(shí),敗血癥組新生大鼠血漿中IL-17水平和肺組織、肝組織中IL-17的表達(dá)分別與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)進(jìn)展至4小時(shí)始,敗血癥組新生大鼠血漿中IL-17水平和肺組織、肝組織中IL-17的表達(dá)分別高于對(duì)照組水平,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

參考文獻(xiàn)

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