科研elisa試劑盒 夾心法與間接法
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根據(jù)免疫識別和信號輸出方式不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競爭法和非直接免疫競爭法等等。其中雙抗體夾心法是比較常見的檢測方法，
雙抗體ELISA夾心法原理
雙抗體夾心法利用兩種針對不同表位的抗體來檢測抗原。首先，將捕獲抗體固定在ELISA板上，用于捕獲待測抗原。然后，加入帶有標(biāo)記的檢測抗體與結(jié)合的抗原結(jié)合。通過檢測標(biāo)記信號的強度，可以定量抗原的濃度。配對抗體的選擇和驗證至關(guān)重要，它們必須能夠同時結(jié)合抗原的不同表位，才能確保實驗的成功。
雙抗體夾心法步驟
①、捕獲抗體通過多種分子間作用力（包括疏水作用、靜電作用和范德華力）結(jié)合到聚苯乙烯ELISA板上。洗滌去除未結(jié)合的抗體后，使用封閉液（例如BSA或明膠）封閉板子上剩余的位點，以減少非特異性結(jié)合，從而降低背景信號并提高檢測的靈敏度。
②、免疫識別。在進行免疫識別步驟時，首先將捕獲抗體包被在聚苯乙烯ELISA板上。然后加入待測樣品，并在37°C下孵育一段時間（通常為1-2小時，具體時間需根據(jù)實驗優(yōu)化）。在此期間，待測樣品中的抗原會與包被在板上的捕獲抗體特異性結(jié)合。高質(zhì)量的捕獲抗體對于實驗的成功至關(guān)重要，它需要具備高特異性、高親和力、高穩(wěn)定性等特性，并且不受樣品中其他成分的干擾。
③、洗板。洗去未結(jié)合的樣品后，加入酶標(biāo)二抗，并在37°C下孵育一段時間（例如1-2小時）。然后洗滌去除未結(jié)合的二抗。
④、酶標(biāo)信號輸出。加入HRP標(biāo)記的二抗與結(jié)合的抗原反應(yīng)，孵育一段時間后洗滌。然后加入TMB顯色劑，并用終止液終止反應(yīng)。通過測定吸光度并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可以確定抗原濃度。
1、用緩沖液將抗體稀釋至1-10ug/ml。在反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次。
2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.05ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3、加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.05ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。
4、加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
5、終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml
6、結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1-10ug/ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.05ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)
3、加酶標(biāo)抗體：于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.05ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。
4、加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
5、終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml
6、結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。